Осахаривание крахмального сырья - ферментативный катализ
Осахаривание крахмала, как и всякая химическая реакция, ускоряется при повышении температуры. Но поскольку в основе реакции лежит катализ, скорость ее зависит также и от состояния катализатора, в данном случае а-aмилаз, которые относятся к белковым телам, коагулирующим при высокой температуре.
В коагулированном состоянии амилаза неактивна. Поэтому скорость реакции осахаривания при повышении температуры возрастает лишь до известного предела, после которого амилаза начинает коагулировать и инактивируется. Когда инактивация достигнет заметных размеров, скорость реакции понижается при температуре полной инактивации амилазы реакция прекращается.
Вопрос о выборе оптимальной температуры процесса осахаривания следует решать исходя из следующих соображений. Учитывая, что процесс осахаривания продолжается в бродильном чане, температура осахаривания не должна превышать предела, после которого наступает инактивация диастаза.
Такой температурой считается 56°. Низкая температура осахаривания (40—50°) нежелательна из-за возможности накопления некоторых видов бактерий, для которых этот температурный интервал является оптимумом.
С точки зрения стерильности процесса и частичной клейстеризации нерастворенного крахмала сырья и солода, желательно поддерживать более высокую температуру. Поэтому периодическом процессе температуру осахаривания несколько повышают против оптимума, доводя ее до 60—62°, в том случае, если в осахаренной массе имеются сахара, декстрины и азотистые соединения, оказывающие защитное действие на амилазу.
Изменение скоростей реакции и инактивации с повышением температуры различно. Поэтому если опыт проводится за малый промежуток времени, то оптимум может лежать при более высоких температурах, чем при длительном опыте.
Уже при 60° большинство ферментов инактивируется. При денатурации (инактивации) ферментов теплота активации этого процесса велика— порядка 40—100 ккал/моль, но так как энтропия активации тоже велика, то такие реакции идут быстро.
Как правило, ферментативный катализ осуществляется путем снижения энергии активации реакции, причем энергия активации ферментативных реакций значительно меньше, чем у тех же реакций, катализируемых неорганическими катализаторами.
С повышением температуры увеличивается реакционная способность молекул субстрата как вследствие возрастания кинетической энергии, так и вследствие поднятия электронов на орбиту с более высоким энергетическим уровнем.
Зависимость константы скорости химической реакции от температуры выражается уравнением Аррениуса
где:
k - константа скорости реакций
R - универсальная газовая постоянная равная 8,3134 кДж/(кмоль-К)
T - абсолютная температура, K
m - энергия активации, кДж*кмоль-1
Поеле интегрирования этого уравнения в пределах Т1 и Т2 получаем
По этому уравнению и известным из опыта кинетическим константам можно вычислить энергию активации, которая для ферментативного гидролиза крахмала (при величине ее, принятой в первые стадии гидролиза) оказалась равной около 45кДж-кмоль- (для кислотного гидролиза — около 130 кДж-кмоль-1).
Влияние температуры на скорость химической реакции выражается также средним температурным коэффициентом Q, представляющим собой отношение кинетических констант при температуре t+10 и t °С:
| Температурный интервал, ~С | Q |
| 25—35 | 1,67 |
| 35—45 | 1,35 |
| 40—50 | 1 ,30 |
| 45—55 | 0,90 |
| 50—60 | 0,58 |
При (Q>1 скорость реакции с повышением температуры возрастает, при Q< 1—убывает, при(Q = 1—остается без изменения.
Температура, соответствующая максимальной скорости реакции, называется оптимальной для действия фермента.
Осахаривающая способность амилазы солода, приготовленного из зерна различных культур (гидролиз 2%-ного раствора крахмала при рН 4,9 в течение 15 мин), по данным Хжонща, приведены на рисунке. Из него видно, что наряду с различием в осахаривающей способности разные солода имеют неодинаковый температурный оптимум, который у одних солодов (кукурузный, просяной, овсяной) приходится на одну строго определенную температуру, у других (ржаной, пшеничный, ячменный) — на некоторый интервал температур.
Для всех солодов, за исключением овсяного, максимальная температура для действия амилазы не превышает 55°С, за ней наступает резкое снижение осахаривающей способности, а при 75—85°С— полное ее прекращение. Это объясняется тепловой денатурацией белковой молекулы фермента и связанной с ней потерей каталитической активности.
Отдельные ферменты амилазного комплекса солода обладают неодинаковой термоустойчивостью. а-aмилаза более термостабильна, чем b-амилаза. Повышение концентрации углеводов в сусле защищает амилазы, повышая их термостабильность.
Оптимальная температура для действия а-амилазы ячменного солода в сусле около 70°С, b-амилазы 60°С. В условиях производства температуру поддерживают в пределах 57—58°С. Меньшая температура, например 40—45°С, нежелательна потому, что может способствовать развитию бактерий, главным образом молочнокислых.
а-Амилазы микробного происхождения различаются по температурному оптимуму, для действия (в °С):
80 — Вас. diastaticus,
70 — Вас. subtilis,
60 —Asp. batatae,
50—52 —Аsр. огуzae,
55— Аsр. amamori и Аsр. niger.
Глюкоамилаза из различных источников имеет следующие температурные оптимумы для действия (в °С):
55—60 — Rhizopus delimar,
55 —Аsр. svamori,
58—60 —Аsр. Ьаtatae,
40 — 50 — из Епdomycopsis
При охлаждении сусла до 30°С (температура брожения) гидролиз крахмала бактериальными а-амилазамн почти прекращается, тогда как плесневой а-амилазой продолжается. Поэтому бактериальные а-амилазы обычно применяют только на стадии подваривания измельченного сырья с целью разжижения замеса.
Осахаривание идет и при температуре брожения.
Этот фактор может оказать на активность ферментов многостороннее действие: изменять ионизацию активного центра, степень стабильности третичной структуры белка и т. д. Существует определенное значение рН, при котором скорость амилолиза оптимальна.
На рисунке (по Клинкенбергу) представлена активность а- и b-амилаз ячменного солода в зависимости от величины рН. Из него видно, что максимальная активность а-амилазы приходится на рН около 5,6, активность b-амилазы — на рН около 4,8.
Как показал Д. Н. Климовский, оптимальное значение рН для действия амилаз зависит от температуры:
| Температура, °С | 20 | 40 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 |
| Оптимум рН для разжижения | — | 4,7 | 4,8 | 5,0 | 5,3 | 5,6 | — |
| Оптимум рН для осахаривания | 4,5 | 4,6 | 4,8 | 4,9 | 5,1 | 5,6 | 5,9 |
По данным Книна, при температуре 20°С оптимум действия а-амилазы находится при рН 5,0, b-амилазы— при рН 4,5.
Де-Клерк принимает за оптимум действия а-амилазы в пивоваренном заторе рН 5,8 (температура 70°С), b-амилазы — рН 5,4 (температура 60—65°С).
Некоторое различие в экспериментальных данных объясняется неодинаковыми составами и концентрацией субстратов.
Необходимо иметь в виду, что все определения значения рН сделаны при температуре 18—20°С (т. е. после охлаждения субстрата).
Так как осахаренная масса имеет довольно сильную буферную систему, то в редких случаях появляется щелочная реакция, но титруемая кислотность массы значительно понижается. Практически можно отметить, что вода, употребляемая для разваривания зерна, при жесткости свыше 12 мг-экв/л должна подкисляться серной кислотой или фильтратом барды.
Вода, употребляемая для приготовления солодового молока, должна подкисляться при жесткости свыше 8 мг-экв/л. Наличие в ней кальциевых солей желательно, так как ионы кальция предотвращают инактивацию а-амилазы при повышенной температуре. Жесткость воды при замачивании зерна для солодоращения не должна превышать 12 мг-экв/л.
Термолабильность ферментов т. е. инактивация их, связанная с разрывом полипептидных связей при повышении температуры,— денатурация белков, приводит к появлению оптимума температурного действия. С ростом температуры увеличивается скорость ферментативной реакции, но увеличивается и инактивация фермента. Поскольку белки являются амфотерными электролитами, для ферментов характерен также оптимум pH.
Так, например, оптимум действия пепсина лежит в зоне pH = 1,5 —2,5, трипсина —8—11, сахаразы, выделенной из дрожжей, — 4,6—5,0, сахаразы из кишечника — 6,2, амилазы из слюны или поджелудочной железы — 6,7—6,8 и т. д.
Некоторые ферменты могут иметь различную величину оптимума pH для разных субстратов. Так, оптимум pH пепсина несколько меняется для разных белковых субстратов, тогда как карбогидразы имеют один и тот же оптимум вне зависимости от вещества, подвергающегося каталитическому превращению.
При увеличении или уменьшении рН активность фермента резко падает, при высокой щелочности или кислотности происходит необратимая денатурация ферментов.
В отличие от оптимума рН, температурный оптимум действия ферментов не является характеристической константой, так как зависит от чистоты фермента, характера субстрата, подвергающегося действию фермента, наличия активаторов или ингибиторов, а также метода исследования реакции.
◇ Перейти к оглавлению.