Основные понятия
о дрожжевых клетках

Дрожжи относятся к одним из самых старейших микроорганизмов, культивируемых человеком. Много веков назад дрожжи уже применялись при получении пива, вина. Однако впервые дрожжевые клетки увидели в 17 веке, когда Левенгуком был сконструирован микроскоп. Последующие полтора столетия заметного прогресса в исследовании дрожжевых клеток не отмечалось.

Только в 19 веке классические исследования Л. Пастера позволили рассматривать процесс спиртового брожения как физиологический процесс, связанный с жизнедеятельностью дрожжевой клетки. Впоследствии были проведены глубокие исследования по обоснованию схемы биохимизма спиртового брожения. Дрожжи сыграли историческую роль в развитии биологических наук, им принадлежит также особая роль в открытии и расшифровке процессов анаэробного и аэробного окисления Сахаров, лежащих в основе существования живого мира.

Особый интерес представляют дрожжи рода Saccharomyces, которые объединяют наибольшее число дрожжей, имеющих промышленное применение в различных отраслях бродильных производств. В результате длительного культивирования в производственных условиях эти дрожжи приобрели характерные признаки, по которым они и отличаются от так называемых «диких» дрожжей.

Для сбраживания крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве до сих пор широко применяют дрожжи S. cerevisiae p.Xl 1, а также расы М -смесь нескольких рас, выделенные в Германии в 1902-1905 г.г. Таким образом, почти 100 лет основная раса спиртовых дрожжей оставалась неизменной.

Фундаментальные исследования по физиологии спиртовых дрожжей, азотистому и фосфорному обмену веществ были проведены проф. Коноваловым С.А. Было подтверждено, что содержание азота в сбраживаемых субстратах в значительной степени определяет скорость синтеза и образование биомассы дрожжей. Показано, что наиболее легко ассимилируемым является азот аминокислот. Азот амидной формы в присутствии аминного азота практически не потребляется. При аэрации потребление амидной формы возрастает.

Наиболее пригодными для дрожжей, с точки зрения расхода энергетических затрат, является азот аминокислот. Процесс использования дрожжами аминокислот в качестве источника азота изучался еще Эрлихом, который показал, что аминокислоты дезаминируются гидролитическим путем, а освободившийся аммиак ассимилируется дрожжами. Но работы, проведенные Торном, Уайтом, Коноваловым, в корне изменили эти взгляды. Была выдвинута теория прямого усвоения аминокислот и доказано, что лучшим источником азота для дрожжей является смесь аминокислот.

Проведенные в институте исследования показали, что наиболее интенсивно процесс роста, развития и размножения дрожжевых клеток протекал на средах, содержащих полную смесь аминокислот, а не индивидуальную аминокислоту, использование которой осуществлялось через переаминирование. В результате была показана возможность прямой ассимиляции аминокислот, что позволяет клетке использовать для питания не только азот, но и углерод, а также экономить энергию, расходуемую на синтез аминокислоты. Обогащение питательной среды свободными аминокислотами в результате протеолиза белков зерна протеолитическими ферментами способствует сокращению расхода сахара на построение биомассы дрожжей и образование побочных продуктов, что приводит в конечном итоге к увеличению выхода спирта.

Создание современных прогрессивных технологий для интенсификации процесса брожения диктует необходимость выделения новых более физиологически активных рас дрожжей, а также разработку различных приемов и способов, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья. Однако в отечественной промышленности недостаточное внимание уделялось созданию новых рас дрожжей.

В последние 10 лет в промышленности были испытаны и внедрены такие новые расы дрожжей, как:
Г-660, гибридная раса, выделенная в Институте генетики РАН путем половой гибридизации S. cerevisiae и S, pombe, обладающая повышенной декстринолитической активностью;

ВПУ-408, полученная во ВНИИПБТ методом автоселекции при росте дрожжей р.Х11в условиях повышенных температур;
термотолерантные расы К-81 (полученные КТИПП и ВНИИПБТ) и XII Т (УкрНИИспиртбиопрод);
гибридные расы дрожжей Y-717, 985, полученные во ВНИИПБТ.

Эти расы спиртовых дрожжей обладали термотолерантными свойствами, но не отличались достаточной устойчивостью к полученным признакам, особенно при длительном культивировании их в производственных условиях. Кроме того, при хранении дрожжей установлено, что некоторые из них склонны к реверсии, диссоциируют и при рассевах дают колонии, обладающие различными физиологическими свойствами. Физиологическая активность дрожжевых клеток, используемых при получении этанола, является одним из важных факторов, определяющих эффективность спиртового производства. Бродильная активность и продуктивность дрожжей, плотность дрожжевой популяции оказывают существенное влияние на стабильное протекание процесса брожения, скорость сбраживания крахмалсодержащего сырья и выход целевого продукта.

Однако в процессе жизнедеятельности дрожжей возникают не зависящие от микроорганизмов факторы, негативно влияющие на физиологическое состояние дрожжевых клеток. К таким факторам можно отнести повышение температуры в процессе дрожжегенерации и спиртового брожения (особенно в летний период времени), которое негативно сказывается на развитии дрожжевых клеток и их жизнедеятельности, что приводит к замедлению брожения, неполному сбраживанию и снижению техноэкономических показателей производства.

Кроме того, в результате создаваемых извне или возникающих в процессе жизнедеятельности дрожжей условии субстратного лимитирования, ингибирования продуктами метаболизма и другими физико-химическими показателями среды (температура, рН, кислотность и др.) происходят необратимые процессы, негативно сказывающиеся на качестве дрожжевых клеток. Продолжительная генерация промышленных рас дрожжей также ведет к ослаблению культур и утрате их технологических возможностей.

Во ВНИИПБТ осуществлены работы по выделению новых, более физиологически активных рас спиртовых дрожжей. Одним из путей, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья является проведение работ по селекции и отбору физиологически активных клонов спиртовых дрожжей, технологически устойчивых к неблагоприятным факторам, обладающих повышенной продуктивностью, осмофильностью и термотолерантностью. Получение таких активных рас спиртовых дрожжей даст возможность повысить эффективность спиртового производства в результате интенсификации процессов дрожжегенерации и брожения, сокращения потерь спирта и сырья.

В связи с вышеизложенным, на первом этапе работы мы проведем сравнительные исследования различных промышленных рас спиртовых дрожжей, выделенных из производственных культур спиртовых заводов и полученных из музеев ВНИИПБТ, ВНИИ генетнки, УкрНИИспиртбиопрод, по бродильной активности, продуктивности и термотолерантности. 1.2. Сравнительные характеристики различных промышленных рас спиртовых дрожжей

Проведенный анализ литературы по используемым расам дрожжей на заводах отрасли показал, что основными промышленными культурами являются Saccharomyces cerevisiae расы: ХП, Y-717, К-81, 660, 86, 985. Следует отметить, что основная масса колоний промышленных рас дрожжей отличалась по культуральным и морфологическим свойствам. Наибольшей бродильной активностью в стандартных условиях на солодовом сусле (30°С, 16-17% СВ) обладали дрожжи расы ХП и K-8'l, а продуктивностью - ХП, К-81, 985 и Y-717. Более устойчивыми к повышенным температурам проявили себя дрожжи S. cerevisiae Y-717, 985, К-81 и ХП-Т.

Селекционные работы по скринингу физиологически активных вариантов проводились из промышленных культур, гибридных штаммов и лабораторных популяций, подвергнутых длительным генерациям при повышенных температурах или концентрациях среды. При проведении селекционных работ основным признаком служила осмофильность и исследуемых штаммов дрожжей их термотолерантность. На первом этапе исследований проводили сравнение спиртовых дрожжей рас ХП, К-81, Г-660, Y-717 и 985 при культивировании их на средах с концентрацией сухих веществ 22-24%. Лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985.

Отбор дрожжей проводили по бродильной активности и продуктивности клеток на 10 и 24 часа брожения в период их максимальной физиологической активности. Наибольшей продуктивностью обладали дрожжи расы 985, которые были использованы в качестве родительского штамма для дальнейших селекционных работ.

Лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985. Концентрация несброженных углеводов (РВ) к 72 часам брожения составила 0,59 и 0,52%, а этанола - 10,8 и 11 ,2 % об., соответственно.

Один из способов повышения рентабельности спиртового производства является использование высококонцентрированного зернового сусла. Важным условием эффективного сбраживания сусла повышенной концентрации должно быть применение дрожжей, обладающих высокой осмофильностью. Известно, что повышение концентрации сбраживаемого сусла и возрастание содержания спирта приводит к затормаживанию процессов дрожжегенерации и брожения. Увеличение концентрации синтезируемого спирта угасающе действует на рост, размножение и бродильную активность дрожжевых клеток.